2023年11月12日中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所劉欣剛研究團(tuán)隊(duì)在Science of the Total Environment雜志發(fā)表了“Imidacloprid affects the visual behavior of Mature zebrafish by mediating the expression of opsin and phototransduction genes and altering the metabolism of neurotransmitters”，揭示了吡蟲(chóng)啉通過(guò)介導(dǎo)視蛋白和光轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)，改變神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，從而影響成年斑馬魚(yú)的視覺(jué)行為。

吡蟲(chóng)啉是硝基亞甲基類內(nèi)吸殺蟲(chóng)劑，是煙堿乙酰膽堿受體的作用體，干擾害蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)使化學(xué)信號(hào)傳遞失靈，吡蟲(chóng)啉對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成重大威脅。本研究探討了吡蟲(chóng)啉對(duì)成年斑馬魚(yú)的視覺(jué)毒性及其分子機(jī)制。視動(dòng)反應(yīng)是指斑馬魚(yú)對(duì)移動(dòng)的目標(biāo)有一種追逐的行為，該反應(yīng)可以用來(lái)檢測(cè)幼魚(yú)和成魚(yú)的視覺(jué)相關(guān)基因突變。視動(dòng)反應(yīng)(OKR)和視運(yùn)動(dòng)反應(yīng)(OMR)測(cè)試是經(jīng)典的用于檢測(cè)斑馬魚(yú)視覺(jué)功能異常的行為測(cè)試（OKR/OMR設(shè)備和分析軟件購(gòu)自上海欣軟）。利用該設(shè)備在環(huán)境相關(guān)濃度暴露吡蟲(chóng)啉21天后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)成年斑馬魚(yú)的視覺(jué)行為受損，Immunofluorescence Experiment表明，斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜中視紫紅質(zhì)的含量發(fā)生了明顯的變化。在成年斑馬魚(yú)中，基因表達(dá)節(jié)律在暗和亮光捕獲中起關(guān)鍵作用，以及光轉(zhuǎn)導(dǎo)的24小時(shí)被顯著破壞。靶向代謝組學(xué)分析顯示，與神經(jīng)遞質(zhì)功能相關(guān)的16種代謝物的含量發(fā)生了顯著變化，并在精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、色氨酸代謝等前三種代謝途徑中富集。這些結(jié)果表明，環(huán)境相關(guān)濃度的吡蟲(chóng)啉暴露可通過(guò)干擾視蛋白的表達(dá)，影響斑馬魚(yú)成蟲(chóng)視網(wǎng)膜中的光轉(zhuǎn)導(dǎo)而引起光毒性。

測(cè)試裝置為透明圓柱形魚(yú)缸，直徑為7 厘米，高7厘米，直徑8.5厘米的滾輪放置在魚(yú)缸周圍有光柵條（12個(gè)周期的黑白條紋）。外部光系統(tǒng)由兩個(gè)圓形光管組成，直徑為21厘米，調(diào)節(jié)亮度。實(shí)驗(yàn)視頻是在帶攝像頭的顯微鏡（OLYMPUS SZX10，日本），可捕獲并記錄實(shí)時(shí)運(yùn)動(dòng)。所有OKR和OMR測(cè)試均已通常在10:00至16:00之間進(jìn)行。OKR/OMR設(shè)備和分析軟件對(duì)從眼球追蹤設(shè)備收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以確定順時(shí)針和逆時(shí)針?lè)较虻木W(wǎng)格刺激對(duì)眼球運(yùn)動(dòng)的影響。OMR測(cè)試中可檢測(cè)運(yùn)動(dòng)距離（m）、運(yùn)動(dòng)速度（m/s）、PPR時(shí)間（s）、PNR時(shí)間（s）和僵直時(shí)間（s）等。

與對(duì)照組相比，暴露于吡蟲(chóng)啉濃度10 μg/L 21天，成年斑馬魚(yú)右眼受到順時(shí)針刺激時(shí)，慢相時(shí)間和反射增益均顯著減少，掃視運(yùn)動(dòng)頻率增加當(dāng)改為逆時(shí)針刺激時(shí)，暴露于10 μg/L吡蟲(chóng)啉的成年斑馬魚(yú)右眼和左眼的慢相位時(shí)間以及反射增益均顯著減少。與對(duì)照組相比，用10 μg/L濃度的吡蟲(chóng)啉處理后各組左右眼的眼跳運(yùn)動(dòng)頻率明顯增強(qiáng)。然而，濃度為1和100 μg/L的吡蟲(chóng)啉的斑馬魚(yú)的參數(shù)沒(méi)有顯著變化。這些結(jié)果表明，濃度為10 μg/L的吡蟲(chóng)啉暴露影響了斑馬魚(yú)對(duì)視覺(jué)刺激的平穩(wěn)跟蹤和準(zhǔn)確、有效的快速眼球運(yùn)動(dòng)的能力，這可能會(huì)影響斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。

成年斑馬魚(yú)在接受順時(shí)針和逆時(shí)針網(wǎng)格刺激時(shí)，行走距離和速度顯著下降，10 μg/L和100 μg/L處理組斑馬魚(yú)的凍結(jié)時(shí)間顯著增加。此外，與對(duì)照組相比，10 μg/L吡蟲(chóng)啉處理的成年斑馬魚(yú)在刺激方向的游泳時(shí)間顯著減少。這些結(jié)果表明，吡蟲(chóng)啉暴露對(duì)成年斑馬魚(yú)的視覺(jué)系統(tǒng)處理和視覺(jué)引導(dǎo)下的自我運(yùn)動(dòng)的能力有負(fù)面影響，證實(shí)了OKR試驗(yàn)的結(jié)果。

作者接下來(lái)進(jìn)行組織病理學(xué)分析，以確定視網(wǎng)膜切片是否發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變，視網(wǎng)膜層是否受到特異性影響。對(duì)照組和用藥組形態(tài)完整，形狀規(guī)則，由神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、內(nèi)叢狀、內(nèi)核、外叢狀、外核層、光感受器和色素細(xì)胞組成。Immunofluorescence Experiment使用特異性抗體標(biāo)記視網(wǎng)膜中相應(yīng)的標(biāo)記物。結(jié)果顯示，Sox2（Sry-box 2，視網(wǎng)膜祖細(xì)胞標(biāo)記物）和Islet1（ISL1基因，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)記物）的陽(yáng)性細(xì)胞密度或陽(yáng)性細(xì)胞百分比均無(wú)顯著差異。然而，與對(duì)照組相比，成年斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜在10 μg/L后的陽(yáng)性細(xì)胞密度和陽(yáng)性細(xì)胞的百分比顯著降低。用藥組中視網(wǎng)膜色素上皮中的一種蛋白質(zhì)Rpe65（類視黃醇異構(gòu)水解酶65）的百分比顯著高于對(duì)照組。

10 μg/L的吡蟲(chóng)啉暴露顯著改變了4個(gè)視蛋白基因的表達(dá)節(jié)律，即opn1mw3、opn1lw2、opn1sw2和rho、一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因gnb3b和一個(gè)抑制蛋白基因arr3a與視網(wǎng)膜中的光轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。此外，與視黃醇代謝相關(guān)的基因rpe65a的相對(duì)表達(dá)量也發(fā)生了顯著變化。然而，相對(duì)表達(dá)水平在24h期間的非視覺(jué)視蛋白基因opn3和opn4b，和sox2，胰島1和hcrt沒(méi)有顯著改變。

通過(guò)靶向代謝組學(xué)分析，研究了成年斑馬魚(yú)中吡蟲(chóng)啉暴露后參與神經(jīng)遞質(zhì)功能的39種代謝物的改變。如圖顯示了吡蟲(chóng)啉處理組與對(duì)照組的39種代謝物含量的熱圖。吡蟲(chóng)啉暴露后，斑馬魚(yú)大腦中16種代謝物水平發(fā)生顯著變化，其中11種代謝物升高。KEGG通路分析顯示，有10條通路顯著富集，其中9條通路參與代謝，1條與遺傳信息處理相關(guān)。前三的代謝途徑是精氨酸生物合成；丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝和色氨酸代謝。網(wǎng)絡(luò)分析可以直觀地探索為一個(gè)交互式網(wǎng)絡(luò)，其節(jié)點(diǎn)（代謝物）大小對(duì)應(yīng)于節(jié)點(diǎn)度和基于兩個(gè)連接節(jié)點(diǎn)之間的相關(guān)性的邊緣厚度。六種富含丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的代謝物和五種富含色氨酸代謝的代謝物主要通過(guò)L-谷氨酸相互作用和影響。

一些研究報(bào)告稱，吡蟲(chóng)啉暴露在高劑量或亞致死劑量下誘發(fā)昆蟲(chóng)視覺(jué)功能障礙。在本研究中，將成年斑馬魚(yú)暴露于環(huán)境相關(guān)濃度的吡蟲(chóng)啉中21天，結(jié)果表明，吡蟲(chóng)啉暴露通過(guò)破壞視蛋白和光傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)相關(guān)基因的表達(dá)節(jié)律，導(dǎo)致斑馬魚(yú)的視覺(jué)行為異常，導(dǎo)致色氨酸代謝失衡谷氨酸系統(tǒng)與光敏功能和視覺(jué)處理有關(guān)。作者的研究證實(shí)了新煙堿類殺蟲(chóng)劑所造成的視覺(jué)毒性風(fēng)險(xiǎn)。此外，研究結(jié)果可能為晝夜節(jié)律和視網(wǎng)膜功能之間的相互作用提供證據(jù)。

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