摘要 光遺傳學(xué)廣義上是借助光感靶向控制工具向效應(yīng)細(xì)胞傳遞不同功能的研究工具。在神經(jīng)科學(xué)研究中，科學(xué)家可以利用光學(xué)手段調(diào)控特定神經(jīng)元亞群(甚至單個(gè)神經(jīng)元)的電活動(dòng)，研究生理和病理情況下神經(jīng)環(huán)路的功能和潛在調(diào)控機(jī)制。光遺傳結(jié)合鈣離子成像技術(shù)，可以在生理調(diào)控的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)觀測神經(jīng)元的響應(yīng)活動(dòng)，有助于從多個(gè)維度定位特定功能的神經(jīng)元集群，進(jìn)一步揭示其在神經(jīng)環(huán)路中的具體作用，用于解釋腦ji病對(duì)整體腦功能網(wǎng)絡(luò)的影響，幫助臨床醫(yī)生更好地理解帕金森病、阿爾茨海默病、癲 等神經(jīng)環(huán)路ji病的發(fā)病機(jī)制，找到潛在的zhi療靶點(diǎn)，改善患者的臨床預(yù)后。

1、光遺傳學(xué)(optogenetics)技術(shù)

1.1 光遺傳學(xué)技術(shù) 腦科學(xué)研究工具的基本功能是記錄神經(jīng)元的活動(dòng)與調(diào)控。隨著成像技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)活動(dòng)記錄目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了從宏觀記錄到微觀記錄的演變，功能磁共振成像 (functional MRI，fMRI)、正電子成像 (positron emission tomography， PET)、腦電圖 (electroencephalography，EEG)、神經(jīng)元鈣成像技術(shù) (calcium imaging) 等可以在不同微觀層面上顯示神經(jīng)元活動(dòng)，單光子及雙光子顯微鏡的出現(xiàn)使得對(duì)神經(jīng)元的觀察可以細(xì)致到單個(gè)神經(jīng)元甚至是細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)如突觸水平。在神經(jīng)元調(diào)控層面， 傳統(tǒng)的調(diào)控方式包括細(xì)胞外電生理刺激、yao物干預(yù)和基因編輯，等。電刺激是zui常用的神經(jīng)元調(diào)控手段， 具有較高的時(shí)間準(zhǔn)確性，但細(xì)胞特異性低。其他方式如yao物干預(yù)或者基因編輯，可以精que到特殊類型細(xì)胞，但時(shí)間分辨率較低。因此，早期的腦功能研究工具尚不能兼顧高時(shí)間分辨率、高空間分辨率和細(xì)胞類型高分辨率。理想的腦科學(xué)研究工具需要兼顧這 3 種分辨率需求，特別是目前對(duì)于腦功能連接網(wǎng)絡(luò)的研究，急需單個(gè)神經(jīng)元和神經(jīng)纖維分辨率下的神經(jīng)元群體的長期調(diào)控與觀察，這就需要突破現(xiàn)有腦功能研究工具的技術(shù)瓶頸。

光遺傳學(xué)是將遺傳學(xué)與光學(xué)相結(jié)合的新技術(shù)，使用遺傳學(xué)手段，常以病毒或者使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為載體， 將光敏蛋白基因?qū)氲侥繕?biāo)細(xì)胞中，細(xì)胞表達(dá)光敏感蛋白，之后利用光學(xué)調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)，光遺傳學(xué)的本質(zhì)是將遺傳學(xué)與光學(xué)方法相結(jié)合從而使活體中特定細(xì)胞獲得或失去特定的功能。

光遺傳學(xué)的應(yīng)用與發(fā)展實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)科學(xué)家用光照控制神經(jīng)元活動(dòng)的設(shè)想，結(jié)合成像等輔助技術(shù)， 具有高時(shí)間特異性、高空間特異性以及高細(xì)胞類型特異性進(jìn)行神經(jīng)元調(diào)控的特性，從各個(gè)層面上進(jìn)行腦科學(xué)研究 。

1.2 光遺傳學(xué)技術(shù)的原理與應(yīng)用方法   光遺傳學(xué)技術(shù)是遺傳學(xué)與光學(xué)技術(shù)的結(jié)合，利用遺傳學(xué)手段， 將光敏感蛋白導(dǎo)入至目標(biāo)細(xì)胞中，之后利用光學(xué)手段刺激目標(biāo)細(xì)胞從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞功能的控制。光遺傳學(xué)技術(shù)的 6個(gè)簡要步驟。

首先是在目標(biāo)神經(jīng)元中表達(dá)光敏蛋白 —— 視蛋白。視蛋白是光遺傳學(xué)中使用zui廣泛的執(zhí)行元件， 是光敏感膜蛋白在受到特定頻率的光線照射后可以實(shí)現(xiàn)暫時(shí)的構(gòu)象變化、執(zhí)行功能。根據(jù)視蛋白種類的不同，可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元的激活或者抑制。實(shí)現(xiàn)光敏蛋白在目標(biāo)細(xì)胞的表達(dá)：

①構(gòu)建遺傳學(xué)元件。

② 選用合適的載體將遺傳學(xué)元件導(dǎo)入目的細(xì)胞進(jìn)行基因改造，常用由病毒、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或者兩者相結(jié)合的方式來實(shí)現(xiàn)的。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物結(jié)合病毒載體注射的方式可以更好的實(shí)現(xiàn)光敏蛋白表達(dá)的細(xì)胞類型與空間特異性，是目前zui廣泛使用的方法，比如 Cre 重組酶小鼠結(jié)合病毒載體導(dǎo)入。

③將構(gòu)建好的病毒載體注射到目的腦區(qū)使其在目標(biāo)神經(jīng)元表達(dá)。這些基因產(chǎn)物感應(yīng)光照后，產(chǎn)生相應(yīng)的構(gòu)象改變，作為光敏感離子通道或離子泵等工作元件而發(fā)揮作用，發(fā)揮蛋白功能、調(diào)控細(xì)胞活動(dòng) 。

④光源調(diào)控元件植入目標(biāo)部位。常用的“光電極”是光纖結(jié)合電極將光源的傳遞與電生理記錄整合到一個(gè)裝置中，從而實(shí)現(xiàn)在使用光源控制神經(jīng)元活動(dòng)的同時(shí)進(jìn)行神經(jīng)活動(dòng)的電生理記錄。

⑤選擇特定波長的光源進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞的活動(dòng)干預(yù)，常用的光源有激光、發(fā)光二極管 (light-emitting diodes，LED)。激光光源優(yōu)勢在于可以使用波段較短的光，實(shí)現(xiàn)不同類型視蛋白的控制，并且可以與光纖有效結(jié)合，便于腦深部的光源導(dǎo)入，腦損傷較小。LED 優(yōu)勢在于價(jià)錢更低，以及具有較多的光源顏色的選擇，可以實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)發(fā)光以及制作成無線移動(dòng)裝置 。⑥實(shí)驗(yàn)過程中輸出數(shù)據(jù)的讀取與分析，涉及到光遺傳學(xué)各種輔助技術(shù)的快速發(fā)展。

光遺傳學(xué)技術(shù)可以與多種數(shù)據(jù)讀取方式相結(jié)合。電生理信號(hào)的讀取是zui常用的方式之一，如光電極， 可以在自由活動(dòng)動(dòng)物身上實(shí)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)的電生理記錄，具有較高的時(shí)間與空間分辨率，但是細(xì)胞類型分辨率較低。采用fMRI 可以從宏觀上對(duì)于腦功能的變化進(jìn)行提示，也是數(shù)據(jù)讀取方式之一，但其時(shí)間、空間、細(xì)胞類型分辨率都較低。光學(xué)信號(hào)讀取具有更好的空間分辨率以及細(xì)胞類型信息。基于染料的成像已經(jīng)用于各種光遺傳學(xué)研究，使用鈣離子染料、電壓敏感染料可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元活動(dòng)的可視化 。神經(jīng)元鈣成像是近年來快速發(fā)展的光遺傳學(xué)數(shù)據(jù)讀取的有效方式。

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